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當(dāng)前位置:首頁 > 產(chǎn)品中心 > 細胞生物學(xué) > 細胞凋亡 > AC12L056/AC12L057EZ555TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(橙紅熒光)

EZ555TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(橙紅熒光)

簡要描述:EZ555TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(橙紅熒光)采用 TUNEL 法,應(yīng)用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡細胞斷裂DNA 的3´-OH 末端催化摻入EZ 555-dUTP。EZ 555-dUTP標記的 DNA 可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細胞儀定量。

  • 產(chǎn)品型號:AC12L056/AC12L057
  • 廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
  • 更新時間:2024-07-01
  • 訪  問  量:2300

詳細介紹

品牌其他品牌貨號AC12L056/AC12L057
規(guī)格20T供貨周期現(xiàn)貨
主要用途可選擇性的檢測凋亡細胞,而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的DNA鏈斷裂細胞應(yīng)用領(lǐng)域生物產(chǎn)業(yè)

EZ 555 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(橙紅熒光)

產(chǎn)品描述

細胞凋亡的一個顯著特點是細胞染色體 DNA 的降解,這是一個較普遍的現(xiàn)象。這種降解非常特異并有規(guī)律,所產(chǎn)生的不同長度的 DNA 片段約為 180 bp-200 bp 的整數(shù)倍,表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)特異的梯狀 Ladder 圖譜,本試劑盒采用 TUNEL 法,應(yīng)用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡細胞斷裂DNA 的3′-OH 末端催化摻入EZ 555-dUTP。EZ 555-dUTP標記的 DNA 可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細胞儀定量。 TUNEL法可以選擇性的檢測凋亡細胞,而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細胞。TUNEL 實驗中, TdT 酶催化 dUTP 摻入斷裂的 DNA 鏈的3′-OH末端。抗原標記的 dUTP(如digoxin-dUTP、*素-dUTP),因為它可以直接進行原位檢測,是一種更快速、直接的檢測手段。

訂購信息

產(chǎn)品名稱

貨號

規(guī)格

EZ555TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(橙紅熒光)

AC12L056

20 T

EZ555TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(橙紅熒光)

AC12L057

50 T

產(chǎn)品組分

組分

20 T

50 T

A.EZ 555 TUNEL Reaction Buffer

1 mL

2 × 1.25 mL

B.TdT Enzyme

20 μL

50 μL

C.Proteinase K (2 mg/mL)

40 μL

100 μL

D.DNase I (2 U/μL)

5 μL

13 μL

E.10 × DNase I Buffer

100 μL

260 μL

運輸與保存

藍冰運輸。-20℃避光保存,有效期24個月。【注】:避免反復(fù)凍融。

實驗材料(自備)

PBS緩沖液(1×,pH~7.4)

0.2% Triton X-100(PBS配制)

0.1% Triton X-100(PBS配制,其中含5 mg/mL BSA)

4%多**醛(PBS配制)

免疫組化筆

脫蠟溶劑(石蠟切片樣本)

石蠟切片處理相關(guān)試劑

抗熒光淬滅封片劑

ddH2O

使用方法

一、實驗設(shè)計

1. 陽性對照(可選):

  DNase I處理制備陽性對照載玻片。DNase I可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶,人為造成細胞凋亡。

2. 陰性對照(可選):

  使用不含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer,用ddH2O替代TdT Enzyme。

3. 實驗處理組。

4. 實驗對照組。

二、實驗步驟

1. 樣本準備:

對于貼壁細胞或細胞涂片

1)PBS清洗1次。【注】:如果擔(dān)心細胞涂片的細胞貼得不牢,可以干燥樣品使細胞貼得更牢。

2固定:加入適量4%**醛PBS配制),室溫固定30 min。PBS清洗2次。

3通透:加入適量0.2% Triton X-100(PBS配制),室溫通透20 min。PBS清洗2次。

4轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。

對于懸浮細胞或細胞懸液

1)收集細胞( 3-5×106個細胞),1000 rpm離心5 min,PBS清洗2次。

2固定:加入適量4%**醛PBS配制)充分重懸細胞,4℃固定30 min。2000 rpm離心5 min,PBS清洗2次。

3通透:加入適量0.2% Triton X-100(PBS配制),室溫通透20 min。2000 rpm離心5 min,PBS清洗2次。

4轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。

石蠟組織切片

1脫蠟與水化:將切片樣本依次放入二甲苯I(10 min)→ 二甲苯II(10 min)→ 100%乙醇I(5 min)→ 100%乙醇II(5 min)→ 95%乙醇(5 min)→ 90%乙醇(5 min)→ 80%乙醇(5 min)→ 70%乙醇(5 min)→ ddH2O沖洗5 min,沖洗2次。【注】:二甲苯有毒,易揮發(fā),請在通風(fēng)櫥中進行此操作。

2用濾紙吸干切片樣本周圍液體,用免疫組化筆圈好樣本輪廓,以便下游通透與標記。

注:若在后續(xù)實驗操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞,需及時補畫。

3通透:按1: 100的比例,將2 mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀釋至終濃度20 µg/mL,在每個樣本上滴加100 µL,使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域,20-37℃孵育20 min。【注】:Proteinase K可通透細胞膜和核膜,從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進入細胞核進行反應(yīng),提高標記效率。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險,過短則可能造成透性處理不充分,影響標記效率。為得到更好的結(jié)果,Proteinase K的濃度、孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進行優(yōu)化。

4PBS漂洗切片2次,每次5 min,用濾紙吸去多余的液體,將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。

注:這一步必須把Proteinase K洗滌干凈,否則會嚴重干擾后續(xù)的標記反應(yīng)。

5轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。

冰凍組織切片

1固定:取出冰凍切片,并回溫至室溫。加入適量4%**醛PBS配制),室溫固定30 min。PBS漂洗2次,每次10 min。【注】:若是擔(dān)心甲醛清洗不干凈,影響最終染色效果??稍诩兹┕潭ㄍ瓿珊蠹尤脒m量2 mg/mL *酸清洗 10 min,中和殘留的固定液,再進行PBS清洗。

2用濾紙吸干切片樣本周圍液體,用免疫組化筆圈好樣本輪廓,以便下游通透與標記。

注:若在后續(xù)實驗操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞,需及時補畫。

3通透:按1: 100的比例,將2 mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀釋至終濃度20 µg/mL,在每個樣本上滴加100 µL,使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域,20-37℃孵育20 min。【注】:Proteinase K可通透細胞膜和核膜,從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進入細胞核進行反應(yīng),提高標記效率。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險,過短則可能造成透性處理不充分,影響標記效率。為得到更好的結(jié)果,Proteinase K的濃度、孵育時間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進行優(yōu)化。

4PBS漂洗切片2次,每次5 min,用濾紙吸去多余的液體,將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。【注】:這一步必須把Proteinase K洗滌干凈,否則會嚴重干擾后續(xù)的標記反應(yīng)。

5轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。

陽性處理(僅陽性對照進行此步驟,其他樣品直接進行TUNEL反應(yīng)步驟)

11: 10的比例用ddH2O將10× DNase I Buffer稀釋成1× DNase I Buffer備用。

2滴加100 µL 1× DNase I Buffer到已處理的樣本上,覆蓋全部樣本區(qū)域,室溫平衡5 min。

31× DNase I Buffer以1: 100稀釋DNase I (2 U/μL)至終濃度20 U/mL的工作液。

4棄去Buffer,加入100 μL濃度為20 U/mL的 DNase I工作液,室溫孵育10 min。

5棄去DNase I工作液,PBS清洗2次。

6轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。

2. TUNEL 反應(yīng)

配制TUNEL反應(yīng)液(即用即配):


1個樣本

5個樣本

10個樣本

TdT酶

1 μL

5 μL

10 μL

EZ 555 TUNEL Reaction Buffer

49 μL

245 μL

490 μL

TUNEL反應(yīng)液總體積

50 μL

250 μL

500 μL

對于貼壁細胞、細胞涂片或組織切片

1每個樣本加入50 μL TUNEL反應(yīng)液,使反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵育適宜的時間(細胞推薦染色時間30min-1h,組織染色時間推薦2h)。【注】:50 μL TUNEL反應(yīng)液適合涂片、切片或96孔板(其他不同孔板可以適當(dāng)調(diào)整TUNEL反應(yīng)液體積,覆蓋細胞即可)。如果待檢測的樣品為涂片、切片或在24孔板、12孔板或6孔板中,可以使用防蒸發(fā)膜,或自行嘗試使用自封袋或者其它適當(dāng)材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片,滴加TUNEL反應(yīng)液后覆蓋在樣品上,可以防止TUNEL反應(yīng)液蒸發(fā),并且使TUNEL反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。

2)棄去TUNEL 反應(yīng)液,PBS漂洗2次,每次5 min。【注】:為了降低背景,PBS漂洗切片1次后,可再用0.1% Triton X-100(PBS配制,其中含5 mg/mL BSA)漂洗3次,每次 5 min,這樣游離的未反應(yīng)的標記物可以清除較干凈。

3(可選)每個樣本加入適量濃度為5 μg/mL 的DAPI染液,室溫避光孵育5 min。染色完成后,棄去DAPI染液,PBS漂洗2次,每次5 min。

4(可選)切片封片:將切片依次在純水、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇中浸沒5 min,最后將切片樣本置于染色缸中以新鮮的二甲苯浸泡,透明化處理2次,每次5 min。脫水完成后,擦去切片周圍的液體,每個樣本滴加50 μL抗熒光淬滅封片劑(抗熒光淬滅封片劑可能會不適用于某些染料,實驗前建議進行預(yù)實驗測試匹配性),蓋上蓋玻片,用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片,去除氣泡以使封片。

5用濾紙吸去多余的液體,向樣本區(qū)域加100 μL PBS保持樣本濕潤,立即在熒光顯微鏡下觀察。

對于懸浮細胞或細胞懸液

1每個樣本管加入50 μL TUNEL反應(yīng)液輕輕重懸細胞,37℃避光孵育30~60 min。每隔15 min用微量移液器輕輕重懸細胞。

2)2000 rpm 離心5 min,棄去TUNEL 反應(yīng)液,加入適量0.1% Triton X-100(PBS配制,其中含5 mg/mL BSA)輕輕重懸細胞,并清洗2次。

3每個樣本管加入100 μL濃度為5 μg/mL的DAPI染液,室溫避光孵育5 min。

4加入400 μL PBS重懸細胞,立即用流式細胞儀檢測或進行涂片后在熒光顯微鏡下觀察。

注意事項

1. 產(chǎn)品僅限于科學(xué)實驗研究使用,不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2. 使用前請將產(chǎn)品瞬時離心至管底,再進行后續(xù)實驗。

3. 染色背景較重或非特異性著色明顯時可適當(dāng)減少染色時間。

4. 實驗時建議增加陰性對照和陽性對照組。

5. 組分A使用時請佩戴口罩、手套,如接觸皮膚,請立即用大量水沖洗。

6. 熒光染料均存在淬滅問題,請盡量注意避光,以減緩熒光淬滅。

7. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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